Análise Genética de Canalopatias Cardíacas em Pacientes Brasileiros e seus Familiares

As arritmias hereditárias são caracterizadas por expressividade variável e penetrância incompleta. Extensos estudos genótipo-fenótipo são necessários para elucidar a base genética dessas doenças. Existem várias razões para estudar a genética molecular das canalopatias, como determinar a epidemiologia molecular dessas doenças, oferecer evidências para uma melhor compreensão da base molecular das doenças, determinar os padrões genéticos de ocorrência (herdados ou novamente) e melhorar a diagnóstico e aconselhamento genético. Além disso, o estudo genético dessas doenças pode levar à descoberta de novas variantes genéticas associadas a essas doenças e à criação de modelos experimentais.

O teste genético é recomendado (Classe I) para qualquer paciente com forte suspeita clínica de canalopatias geneticamente herdadas, incluindo síndrome do QT longo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, síndrome de Brugada e síndrome do QT curto. Testes genéticos específicos para a mutação identificada no caso índice também são recomendados (Classe I) para familiares.

A genética molecular das canalopatias cardíacas tem sido extensivamente estudada em populações de países desenvolvidos. No passado, os métodos mais usados eram o sequenciamento de um ou poucos genes suspeitos. Mais recentemente, painéis mais amplos ou mesmo o sequenciamento do exoma completo têm sido cada vez mais utilizados. Este procedimento permitiu a descoberta de um número crescente de variantes genéticas.

Embora a base genética de muitos casos dessas doenças seja conhecida, muitas famílias ainda não têm uma causa genética definida. Além disso, é difícil prever a patogenicidade e a evolução clínica de mutações individuais. Avanços recentes na geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) podem permitir progressos consideráveis na pesquisa translacional de arritmias.

Desde a descoberta da primeira canalopatia em 1995, a utilização de testes genéticos para fins diagnósticos e prognósticos evoluiu consideravelmente e passou a ser utilizada na prática clínica e não apenas para fins de pesquisa. Apesar de todos esses avanços, o uso do sequenciamento de DNA para determinar a presença ou ausência de algumas doenças é um desafio, pois todas essas síndromes clínicas podem estar associadas a diferentes mutações, muitas das quais ainda não foram descritas. O sequenciamento genético de pacientes com arritmias hereditárias é essencial não só para fornecer informações clínicas relacionadas a mutações bem caracterizadas, mas também para contribuir para a descoberta de novas alterações genéticas. Na síndrome de Brugada, por exemplo, embora 12 genótipos tenham sido descritos até o momento, alterações genéticas foram identificadas em apenas 30% dos casos. A razão dessas discrepâncias está relacionada ao conhecimento ainda incompleto de todas as vias envolvidas na função e regulação dos canais iônicos cardíacos.

Breves descrições das canalopatias mais estudadas são apresentadas a seguir. Síndrome do QT longo (LQTS) Esta doença foi identificada em diferentes áreas do mundo, em diferentes grupos étnicos. Embora pelo menos 13 formas da doença tenham sido descritas até o momento, a causa em aproximadamente 20% dos casos ainda não está definida.

A doença é caracterizada por prolongamento do intervalo QT e eventos arrítmicos. As arritmias comumente encontradas nesses pacientes são episódios de taquicardia ventricular polimórfica (torsades de pointes) que causam tontura e síncope, podendo evoluir para fibrilação ventricular e morte súbita. Indivíduos acometidos pela SQTL são mais susceptíveis à fibrilação atrial do que a população em geral. Sendo a canalopatia mais estudada, a correlação entre variantes genéticas e evolução clínica é muito alta. Atualmente, sabe-se que o exercício e o estresse emocional desencadeiam arritmias em pacientes com SQT1 e que pacientes com SQT3 geralmente apresentam episódios de arritmia durante o sono. Sabe-se também que a LQT8 é extremamente agressiva, com sintomas que aparecem precocemente e uma má resposta ao tratamento. Pelo menos 20% dos casos de SQTL geneticamente comprovados têm ECG normal. Por todos esses motivos, a SQTL é um exemplo de como a caracterização genética pode auxiliar no entendimento da fisiopatologia de uma condição clínica e melhorar o tratamento.

Síndrome de Brugada (SBR) Esta síndrome clínica é caracterizada por episódios espontâneos de taquicardia ventricular polimórfica que pode degenerar em fibrilação ventricular e padrão eletrocardiográfico típico de elevação do segmento ST de V1 a V3.

A prevalência da doença é maior na Ásia onde, em algumas localidades, é considerada a causa mais comum de morte natural entre homens com menos de 50 anos.

A síndrome geralmente se inicia na idade adulta, sendo rara em crianças. Vários genótipos já foram descritos, tipicamente envolvendo diminuição das correntes de sódio (Na) ou aumento das correntes de potássio (K). O padrão de herança é autossômico dominante, portanto, espera-se que metade dos membros da família seja afetada. Como mencionado anteriormente para SQTL, a genética molecular de vários casos com critérios clínicos para a síndrome de Brugada ainda não foi elucidada.

O tratamento de escolha é o implante de um desfibrilador. Nenhum tratamento farmacológico é seguro, embora isoproterenol ou quinidina possam ser usados em casos de tempestades elétricas. A ablação está sendo investigada para controlar alguns desses pacientes.

O diagnóstico é feito a partir do eletrocardiograma (ECG) com padrão típico associado às evidências clínicas da doença. Ocasionalmente, um teste de drogas provocativo pode ser necessário, pois o padrão típico pode ser transitório. Bloqueadores dos canais de Na, como a ajmalina, podem ajudar a identificar esses pacientes.

Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC) Esta doença é caracterizada por eventos arrítmicos de taquicardia ventricular polimórfica ou bidirecional desencadeada por um estímulo adrenérgico. O ECG basal e os exames de imagem são inespecíficos. As arritmias ventriculares são observadas exclusivamente durante os esforços, de modo que o teste de estresse e o Holter são métodos diagnósticos importantes. Dois tipos de mutações foram descritos até agora. Um no receptor de rianodina e outro no gene que codifica a calsequestrina. Apenas 60% dos indivíduos diagnosticados carregam uma dessas mutações e, portanto, outros genes devem estar envolvidos. Outras condições Várias outras síndromes genéticas arrítmicas foram descritas, como síndrome do QT curto, síndrome da morte súbita inexplicável, fibrilação ventricular idiopática, repolarização precoce e algumas formas genéticas de fibrilação atrial. Muitos pacientes são diagnosticados após um episódio de morte súbita abortada. Uma melhor categorização genética desses casos poderia ajudar a entender melhor os mecanismos envolvidos nessas doenças e melhorar o tratamento. A triagem familiar e o aconselhamento genético adequado são essenciais.

OBJETIVOS OBJETIVO PRINCIPAL Este estudo visa realizar uma análise genética abrangente das canalopatias cardíacas em pacientes brasileiros e suas famílias.

OBJETIVOS SECUNDÁRIOS Descobrir novas variantes genéticas causais ou associadas a arritmias. Determinar a epidemiologia molecular dessas doenças. Encontrar evidências para uma melhor compreensão da base molecular dessas doenças.

Permite a criação de modelos experimentais. Determinar os padrões genéticos de ocorrência (herdados ou novos, entre outros). Permitir uma melhora no diagnóstico. Possibilitar uma melhoria no aconselhamento genético. HIPÓTESES DE

A análise genética vai melhorar o diagnóstico e o aconselhamento genético de pacientes e seus familiares. O diagnóstico precoce pode prevenir a morte súbita em alguns casos. Existe a possibilidade de detectar novas variantes genéticas associadas a canalopatias. MÉTODOS

FORMA DE ESTUDO E POPULAÇÃO Serão recrutados 20 pacientes e 80 familiares (total de 100 indivíduos) acompanhados pelo grupo de arritmia da Rede D'Or. O número total de indivíduos a serem incluídos no estudo refere-se a uma amostra de conveniência baseada em pacientes atualmente acompanhados pelo grupo de especialistas da Rede D'Or que fazem parte do estudo e seus familiares. A escolha de até 4 membros da família por probando justifica-se pelo fato de que esse número de parentes é, na maioria das vezes, suficiente para determinar o padrão de ocorrência e segregação dos fenótipos.

A especificação dos familiares de cada probando a ser incluído será feita caso a caso, dependendo do padrão de herança genética, da composição familiar e da disponibilidade de amostras de outros membros da família. O padrão de herança de variantes genéticas causais ou associadas a fenótipos definidos conjuntamente como canalopatias cardíacas é, mais comumente, autossômico dominante. Nesse contexto, o teste genético de ambos os pais e, sempre que possível, de parentes de primeiro grau afetados ou não pelo fenótipo é suficiente para o estabelecimento ou exclusão da causalidade. Embora menos comuns, casos esporádicos também podem ser vistos. Nesses casos, a variante genética patogênica não deve ser detectada nos pais, mas testá-los é necessário para confirmar o padrão esporádico. Nestes casos, irmãos e/ou parentes de primeiro grau só devem ser testados na ausência dos pais.

Trata-se de um estudo piloto que fornecerá informações sobre a população acometida por essas doenças em nosso país. Todos os pacientes elegíveis, acometidos por canalopatias e acompanhados em hospitais e clínicas pertencentes à Rede D'Or São Luiz no Rio de Janeiro e familiares selecionados, serão convidados a participar do estudo. O sequenciamento do DNA será realizado 3 ± 2 meses após a inclusão. A análise fenotípica será realizada 2 ± 1 meses após a inclusão e consistirá em avaliação clínica, ecocardiografia, Holter de 24 horas ou monitoramento eletrocardiográfico prolongado (ficha de coleta de dados - Anexo B). Será realizada uma análise genótipo-fenótipo completa e integrada dos casos incluídos. Os pacientes e seus familiares serão acompanhados por no mínimo 2 anos e no máximo 5 anos e serão avaliados anualmente com consultas clínicas e com os mesmos métodos complementares descritos acima. PROCEDIMENTOS DE

Coleta e purificação de amostras de DNA O DNA genômico será purificado a partir de sangue periférico ou swabs bucais. O sangue total será coletado por flebotomia periférica em tubos contendo K2EDTA como anticoagulante. As amostras de sangue serão armazenadas a 4-8 oC por até uma semana antes da purificação do DNA. Os swabs bucais serão coletados usando o kit ORAcollect • DNA (OCR-100) (DNA Genotek Inc., Canadá). O DNA genômico de amostras de sangue total ou swab bucal será purificado usando o DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN).

A análise de variantes genéticas germinativas (herdadas ou de novo) por sequenciamento de DNA, seja pelo método de Sanger ou por sequenciamento de nova geração, não é influenciada pelo tecido ou fluido corporal do qual o DNA é purificado. Portanto, sangue periférico ou esfregaços orais/saliva podem ser usados como fonte de DNA sem qualquer comprometimento técnico ou introdução de viés. Assim, a escolha do sangue ou swab oral será determinada essencialmente pelo conforto e comodidade para o participante da pesquisa e visando o uso racional dos recursos disponíveis. Quantificação do DNA de

e controle de qualidade O DNA genômico purificado será quantificado por espectrofotometria ultravioleta utilizando o espectrofotômetro de microvolume NanoDrop (ThermoFisher Scientific). A integridade do DNA será medida por eletroforese em gel de agarose e utilizando o sistema Agilent 4200 TapeStation.

Estratégia de análise genética Na fase inicial de descoberta, 20 probandos serão selecionados para análise de variantes de sequência e número de cópias dentro de um painel de genes candidatos selecionados. As variáveis causais suspeitas identificadas nesta fase inicial serão posteriormente analisadas em até 4 familiares ou parentes de primeiro grau para cada probando.

Painel genético e critérios de seleção de genes Os genes candidatos incluídos no painel foram selecionados a partir de pesquisas no banco de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), por meio de revisão da literatura e consensos, recomendações e diretrizes emitidas por painéis e sociedades especializadas. A lista final de genes candidatos foi estabelecida para incluir genes clinicamente informativos, ou seja, que auxiliam em decisões diagnósticas ou terapêuticas, e evidências experimentais indicativas de envolvimento genético na fisiopatologia das arritmias.

Sequenciamento de nova geração Os genes candidatos serão analisados para a detecção de variantes de sequência e número de cópias usando o sequenciamento de nova geração. Toda a região de codificação e os limites íntron-exon serão sequenciados usando a tecnologia Ampliseq™. Os oligonucleotídeos para amplificação das regiões de interesse serão projetados utilizando a ferramenta online Ion AmpliSeq Designer. As bibliotecas de sequenciamento serão geradas usando o Ion AmpliSeq ™ Library Kit no Ion OneTouch 2 System (ThermoFisher Scientific). O sequenciamento será realizado em um sequenciador Ion Personal Genome Machine (PGM) utilizando o Ion 318™ Chip v2 BC e os reagentes Ion PGM™ Hi-Q™ View Sequencing (ThermoFisher Scientific). A análise do sequenciamento será realizada por meio do software Ion Reporter™ (ThermoFisher Scientific).

Interpretação e reporte de variantes de sequência. A interpretação e o registro das variantes de sequência serão realizados de acordo com a recomendação consensual do American College of Medical Genetics and Genomics, da Association for Molecular Pathology e do College of American Pathologists. Resumidamente, para descrever variantes identificadas em genes que causam distúrbios mendelianos, esse consenso recomenda o uso de termos padronizados: patogênico, provavelmente patogênico, significado incerto, provavelmente benigno e benigno. De acordo com essa recomendação, o processo de classificação de variantes nessas cinco categorias é baseado em uma série de diferentes tipos de evidências, como dados populacionais, simulações de computador, dados funcionais e dados de segregação genética.

A avaliação da patogenicidade das variantes genéticas detectadas será feita de forma independente, ou seja, "cega", pelos especialistas. A avaliação clínica dos pacientes e a determinação do fenótipo serão feitas pelos especialistas em arritmia do grupo sob supervisão do Dr. Nilson Araújo. A avaliação genética será feita de forma 'cega' pelo Dr. Marcelo Reis. Em caso de divergência entre a variante encontrada e o fenótipo, os achados serão revistos pela Dra. Luciana Sacilotto (especialista em arritmia com experiência em genética clínica) e pela Dra. Carolina Bustamante (especialista em genética molecular).

Previsão computacional do efeito funcional de variantes genéticas Para estimar os efeitos funcionais das variantes de sequência, será utilizada uma série de ferramentas disponíveis publicamente. Esses algoritmos consideram a conservação evolucionária de resíduos de aminoácidos e domínios de proteína conservados, estrutura e função de proteína, modelos de Hiden Markov e lógica dependente de posição. Sempre que disponíveis, dados experimentais funcionais in vitro sobre o efeito de variantes de sequências específicas também serão considerados para interpretação.

Critérios de Inclusão:

• Pacientes da Rede D'or São Luiz e seus familiares
• Pacientes com arritmia e seus familiares
• Presença de padrão de herança de variantes genéticas causais ou associadas a fenótipos definidos conjuntamente como canalopatias cardíacas e seus familiares

Critérios de Exclusão:

• Nenhum

Código do estudo:

NCT04832126

Tipo de estudo:

Observacional

Data de início:

janeiro / 2018

Data de finalização inicial:

agosto / 2021

Data de finalização estimada:

julho / 2024

Número de participantes:

100

Aceita voluntários saudáveis?

Não