Moléculas de sinalização derivadas de cultura de células-tronco mesenquimais autógenas como intensificadores da formação óssea em enxerto ósseo

1. Objetivos e Hipóteses

Com base em estudos previamente relatados e seguindo uma abordagem translacional, uma hipótese de que o efeito parácrino associado a fatores de crescimento autógenos cultivados e citocinas em concentrações fisiológicas atuando localmente em locais enxertados pode promover uma resposta celular mais rápida e/ou mais eficiente e, consequentemente, induzir uma formação óssea mais significativa/rápida foi considerada. A presença dessas moléculas adicionadas a substitutos ósseos sintéticos pode atuar positivamente em termos de recrutamento celular local (quimiotaxia), proliferação, diferenciação e síntese de proteínas ósseas. Além disso, riscos biológicos recorrentes envolvidos em compostos de enxerto celular de engenharia de tecidos convencionais, geralmente ligados à manipulação ex vivo de células em termos de tumorigenicidade, imunogenicidade e o fenômeno de desdiferenciação celular relatado anteriormente, seriam mitigados pela exclusão do elemento celular desse processo, como eles são considerados por alguns relatos como apresentando comportamento mitótico imprevisível uma vez cultivados artificialmente. composto de enxerto contendo meio de cultura de células autógenas concentrado (CM) e um substituto ósseo sintético à base de hidroxilapatita/beta-tricálcio fosfato (cerâmica HP/β-TCP). Os objetivos específicos incluem análises da densidade do tecido calcificado neoformado por tomografia computadorizada (CBCTs), expressão de marcadores imuno-histoquímicos específicos de formação óssea (RT-PCR) e avaliação histomorfométrica da quantidade óssea. Em um modelo de estudo de boca dividida, a formação óssea resultante após o enxerto de HP/β-TCP com e sem CM será analisada, comparada e quantificada em diferentes momentos.

2. Materiais e Métodos

2.1- Desenho do estudo

Foi escolhido como desenho de estudo para a presente investigação um ensaio clínico randomizado controlado prospectivo de boca dividida. Após aprovação do protocolo pelo Comitê de Ética em Pesquisa e registro na plataforma Clinical Trials.gov, seguindo as orientações do CONSORT, 20 pacientes consecutivos que buscam reabilitação oral maxilar no Departamento de Odontologia Protética da Faculdade de Ciências da Saúde e da Vida - PUCRS, Brasil, serão ser convidado a participar da presente investigação.

2.2 - Lipoplastia e colheita/cultura de células estaminais adiposas humanas (hASCs).

Para a colheita das hASCs, será proposto um procedimento de lipoplastia abdominal e realizado mediante consentimento informado assinado. Sob sedação intravenosa e liberação de oxigênio suplementar com cateter oral, juntamente com anestesia local, será realizada uma técnica cirúrgica de lipoplastia padrão. Conforme descrito anteriormente, desse material de lipoaspiração, serão transferidos 25 a 30 ml de gordura para um tubo Falcon de 50 ml. A gordura será então lavada por centrifugação (430Å~g 10 min), sendo a camada superior de gordura transferida para um novo tubo Falcon, onde igual volume de solução de colagenase será adicionada à mistura e incubada a 37°C em água banho. Após a centrifugação, a camada superior de gordura será descartada e o sobrenadante removido. O pellet celular restante contendo as hASCs será ressuspenso com 15 ml de meio de cultura. Após a adição de 15 ml de meio de cultura morno, a suspensão de células será transferida para um frasco de cultura T175. As hASCs serão incubadas em ambiente umidificado a 37°C e 5% de CO2. Em seguida, o pellet celular será ressuspenso em meio de cultura quente e semeado em novos frascos de cultura celular.

2.3 - Preparação e análise do meio de cultura concentrado (MC)

A cultura de células-tronco e a preparação do CM serão realizadas em uma instalação certificada GMP para produtos de medicina regenerativa. Inicialmente, os perfis de antígenos de superfície das hASCs isoladas na terceira passagem serão caracterizados por citometria de fluxo. A presença de marcadores CD73, CD90, CD105 e CD44 e a ausência de CD34, CD45, CD11b, CD19 e HLA-DR serão avaliadas para confirmar o fenótipo celular desejado conforme recomendado pelos protocolos da Sociedade Internacional de Terapia Celular.[ Em seguida, uma amostra dessas células também será caracterizada por coloração (Alizarin Red S) de acordo com as instruções do fabricante. A expansão celular e o CM serão gerados seguindo os protocolos padrão de cultura de células-tronco. Antes do uso clínico, o CM será examinado não apenas quanto à contaminação com bactérias, fungos ou micoplasmas, mas também quanto à infecção por vírus, incluindo vírus da hepatite B e C, imunodeficiência humana e leucemia de células T humanas. Em seguida, o CM será devidamente refrigerado e encaminhado para aplicação clínica (até 6 horas), para evitar a desnaturação/inativação a longo prazo das moléculas sinalizadoras presentes, conforme sugerido anteriormente.

2.4 - Procedimento de elevação do assoalho do seio maxilar

Sob sedação IV e liberação de oxigênio suplementar com cateter oral, juntamente com anestesia local, o osso maxilar será enxertado internamente por perfuração de um acesso na parede lateral do seio maxilar. A dissecção da membrana sinusal com liberação e elevação cuidadosas também será realizada. A randomização pré-operatória por números aleatórios gerados por computador será usada para determinar os seios de teste e controle de cada paciente. O assoalho ósseo do seio maxilar no local de teste será aumentado com 4 a 5 g de um substituto ósseo sintético (BoneCeramic™ 1-2 mm) misturado com 10 a 15 ml de CM. O local controle receberá quantidade semelhante de substituto ósseo embebido em 10 a 15 ml de solução salina. Os pacientes terão alta hospitalar 2h após a cirurgia. Eles serão instruídos sobre higiene pós-operatória e comportamento alimentar. Todos os pacientes receberão antibióticos pós-operatórios e terapias anti-inflamatórias.

2.5 - Colocação do implante e colheita de biópsias ósseas

Após 6 meses de cicatrização, a colocação do implante seguirá os protocolos cirúrgicos de rotina conforme recomendado pelo fabricante do implante. Sob anestesia local, será realizada incisão linear mesocrestal e retalho de espessura total com incisões liberadoras sempre que necessário. Em seguida, com um contra-ângulo 16:1 acoplado a uma unidade cirúrgica e uma broca trefina (Ø 3mm), a área enxertada correspondente às regiões de 2º pré-molar, 1º e 2º molar será biopsiada em ambos os lados direito e esquerdo da maxila (n=06 sítios por paciente), guiados por um stent cirúrgico de resina acrílica previamente confeccionado. As biópsias ósseas serão então divididas em dois segmentos, onde um será armazenado em solução de formol a 4% para análise histológica e o outro em frascos Eppendorf com RNALater para análise por RT-PCR. Em seguida, será seguida a sequência de brocas cirúrgicas de implantes recomendadas pelo fabricante para a colocação de 6 a 8 implantes por paciente. O registro da estabilidade primária na inserção será feito por torquímetro manual e classificado em três grupos. Um pilar de cicatrização será então colocado e o fechamento da ferida será conduzido com material de sutura não reabsorvível. Um protocolo de cicatrização de 6 meses em um estágio será adotado para todos os implantes.

2.6 - Análise de imagens CBCT

Imagens CBCT de alta resolução serão obtidas em três momentos diferentes como parte do protocolo de tratamento, ou seja, no enxerto ósseo pré-operatório [baseline], 90 [T1] e 180 [T2] dias ( colocação de implantes pré-operatório), visando tanto o planejamento cirúrgico pré-operatório quanto a avaliação pós-operatória da formação óssea. Os parâmetros morfométricos ósseos serão calculados em análise 3D de acordo com as recomendações da American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) como proposto anteriormente, e a análise estatística será utilizada para identificar as melhores combinações de parâmetros visando diferenciar o osso trabecular em três ossos categorias: (i) esparso relacionado a uma estrutura óssea frouxa, (ii) intermediário relacionado a um osso trabecular bem estruturado e (iii) tipo de osso denso relacionado a uma área óssea maciça com pouco espaço entre as trabéculas.

2.7 - Análises histológicas e histomorfométricas

Após a remoção das biópsias do enxerto na colocação do implante, os blocos ósseos contendo os sítios ósseos controle e teste serão moldados e descalcificados com 5% HNO3. Os blocos serão desidratados em uma série graduada de álcool, clarificados com xileno e embutidos em resina. Em seguida, a resina será polimerizada em câmara de luz ultravioleta por 10h. Utilizando uma microsserra diamantada, um total de três fatias de 3 μm de espessura de cada bloco serão retificadas transversalmente ao longo eixo de cada corpo de prova a 50, 100 e 150 μm de sua porção externa. Após isso, será feita a coloração de rotina com hematoxilina-eosina (HE), Azur II e pararosanilina com o objetivo de diferenciar entre partículas de HP/β-TCP e osso neoformado. A análise microscópica será realizada em aumento de 24X usando um estereomicroscópio óptico conectado a uma câmera digital. A análise das imagens será realizada por meio do software ImageJ®.

2.8 - Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR)

Após a preparação das biópsias dos enxertos coletados para extração de RNA, será aplicada análise em tempo real da reação em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR) para quantificar a fosfatase alcalina, fator de crescimento endotelial vascular, osteonectina, osteopontina e colágeno tipo 1.

Critérios de inclusão:

• pacientes >35 anos.
• apresentando maxila totalmente edêntula altamente atrófica (altura óssea residual < 5 mm).
• Necessita de aumento bilateral do assoalho do seio maxilar visando reabilitação bucal total implantossuportada.
• ter extraído dentes pelo menos 8 semanas antes do aumento ósseo.

Critério de Exclusão:

• fumantes, usuários de drogas ilícitas e consumidores diários de álcool.
• doentes com doenças metabólicas e/ou sistémicas que impossibilitam a cicatrização (ex: diabetes descompensada, alterações leucocitárias ou da coagulação, imunossupressão).
• história de radioterapia na região da cabeça ou pescoço.
• usuários de terapia à base de bisfosfonatos.
• intolerante à anestesia geral/local.

As seguintes instituições estão de alguma forma contribuindo com este estudo clínico.

• ITI International Team for Implantology, Switzerland
• KU Leuven
• Rio Grande do Sul Brain Institute (InsCer)

Código do estudo:

NCT04998058

Tipo de estudo:

Intervencional

Data de início:

dezembro / 2024

Data de finalização inicial:

agosto / 2025

Data de finalização estimada:

dezembro / 2025

Número de participantes:

20

Aceita voluntários saudáveis?

Sim